جداسازی و تمایز سلول های بنیادی پوست انسانی به سلول های تولید کننده انسولین

Isolation and differentiation of dermal stem cells into insulin producing cells


چاپ صفحه
پژوهان
صفحه نخست سامانه
مجری و همکاران
مجری و همکاران
دانلود
دانلود
علوم پزشکی بابل
علوم پزشکی بابل

اطلاعات کلی طرح
hide/show

کد رهگیری طرح 8929311
کد مصوب طرح 8929311
کد طرح در واحد ارائه دهنده 625
شماره ثبت در دبیرخانه 2643
عنوان فارسی طرح جداسازی و تمایز سلول های بنیادی پوست انسانی به سلول های تولید کننده انسولین
عنوان لاتین طرح Isolation and differentiation of dermal stem cells into insulin producing cells
محل اجرای طرح مرکز تحقیقات بیولوژی و سلولی مولکولی
رسته مطالعاتی پایه
سازمان مجری دانشگاه علوم پزشکی بابل
تاریخ ارائه طرح 1389/07/26
تاریخ تصویب 1389/07/27
تاریخ شروع 1389/07/27
تاریخ خاتمه 1390/10/27
تاریخ خاتمه مصوب شورا
وضعیت گردش کار طرح های در دست اجرا

اطلاعات مجری و همکاران
hide/show

نام و نام‌خانوادگی سمت در طرح نوع همکاری درجه‌تحصیلی پست الکترونیک
امراله مصطفی زادهمجریمجری اولدکتری تخصصیAmrolah65@yahoo.com
علی متولی زاده اردکانیمجریمجری دوم Ardekani@avicenna.ac.ir
زلیخا معززیهمکار اصلیهمکار اصلیدکتری فوق تخصص بالینیz_moazezi@yahoo.com
هاله اخوان نیاکیهمکار اصلیهمکار اصلیدکتری تخصصیhalehakhavan@yahoo.com
عباس هادی پورهمکار اصلیهمکار اصلیدکتری فوق تخصص بالینیa_hadipoor@yahoo.com
ساره پندآموزهمکار اصلیهمکار اصلی sareh_158@yahoo.com

محققان در پی استفاده از سلول های بنیادی شبه جنینی (embryonic stem cell-like cells) هستند که در نتیجه تغییرات ژنتیکی، از سلول های سوماتیک به وجود می آیند ( iPS cells: induced pluripotent stem cells) [12-11]. Tateishi و همکارانش در طی تحقیقی نشان دادند که سلول های بنیادی تحریک شده ی (iPS) حاصل از فیبروبلاست های پوست، قادر به تولید سلول های انسولین ساز می باشند، اما مانع اصلی بر سر راه موفقیت این روش، دستکاری های ژنتیکی صورت گرفته است، که می تواند در موارد درمانی آینده مشکل زا باشد[13]. در سال 2007، Chen و همکارانش یک جمعیت سلولی را از فیبروبلاست های پوستی جدا نمودند که قادر به تمایز به سلول های مزودرمی، اکتودرمی و اندودرمی در شرایط In vitro بودند[14]، و در سال 2009 این گروه توانایی این جمعیت سلولی را، جهت تمایز به سلول های پانکراسی بررسی نمودند که علاوه بر دسترسی آسان دارای قدرت تمایز بالا نیز می باشند [15]، ولی از آنجائی که این جمعیت سلولی از فیبروبلاست های پوست، به تازگی شناسایی شده اند ، تاکنون تنها یک مقاله در زمینه ی توان این سلول ها برای تبدیل شدن به سلول های انسولین ساز به چاپ رسیده است و از این جهت، روش ذکر شده جهت تحریک سلول های بنیادی فیبروبلاستی موجود در ناحیه ی درم ، به منظور هدایت این سلول ها به سمت تخصصی شدن ، متعهد شدن و در نهایت تمایز یافتن آن ها براساس سایر آزمایشات مشابه موجود در این زمینه صورت می گیرد [2-16-17]. فهرست کلی فصول هدف از اجرا جداسازی وتمایز سلول های بنیادی پوست انسانی به سلول های تولیدکننده ی انسولین برای اولین بار در ایران فرضیات اهداف و فرضیات: # نوع هدف یافرضیه عنوان هدف یافرضیه 1 هدف اصلی تثبیت سلول های بنیادی پوست درشرایط In vitro 2 هدف اصلی تمایزسلول های بنیادی تثبیت شده در شرایط In vitro ، به سمت سلول های تولید کننده انسولین 3 هدف فرعی 1- تثبیت کلون های سلولی مشتق شده ازتک سلول های بنیادی جداشده ازپوست2- تمایز کلون های سلول های بنیادی تثبیت شده به سمت سلول های بتا پانکراسی3-تأیید تمایز سلول های بنیادی با روش ایمونوسیتوشیمی4-تأیید تمایز سلول های بنیادی با روش RT-PCR 5-تأیید ترشح انسولین در محیط کشت سلول های بنیادی تمایز یافته 4 هدف کاربردی استفاده از سلول های بنیادی تمایز یافته ی قادر به تولید انسولین، در درمان بیماران دیابتی در ایران 5 فرضیه سلول های بنیادی جداشده از پوست انسان قادرند درشرایط In vitro به سلول های تولید کننده ی انسولین تمایز یابند. چه موسساتی می توانند از نتایج طرح استفاده نمایند ؟ در صورت ساخت دستگاه نظر صنعت و داوران کلمات کلیدی روش پژوهش وتکنیکهای اجرایی خلاصه روش اجرا طرح: در این مطالعه ابتدا نمونه های تهیه شده از پوست ختنه گاه با PBS استریل، شستشو و لایه ی subcutaneous آنها جدا شده و بعد با Dispase ناحیه ی اپیدرم جدا می شود و سپس ناحیه ی درم خرد و به وسیله Collagenase هضم می گردد و محلول حاصل نیز از صافی سلولی عبور داده می شود و پس از سانتریفیوژ و حل شدن در محیط کشتDMEM و شمارش سلولی، به نحوی در پلیت 96 خانه کشت داده می شوند، که کلون حاصل از تکثیر هر یک از سلول های بنیادی فیبروبلاستی درم را بتوان پس از چند هفته در خانه ها مشاهده نمود، و پس از رسیدن جمعیت هر کلون به حدود 104cells DMEM-HG, 20% FBS نگهداری و بعد از آن در محیط کشت DMEM-HGوFBS 20% حاویb-FGF به مدت 24 ساعت قرار می گیرند و پس از آن به منظور تمایز آن ها به سمت سلول های اندودرمی به مدت24 ساعت درمحیط کشتDMEM-HGو 1% DMSO به همراه BHA و Extendin-4 نگهداری شده و بعد از این مرحله، جهت متعهد شدن سلول ها، 4 روز درمحیط کشتRPMI 1640 به همراه 10%FBS ، گلوکز، سدیم پیروات، HEPES ، b-FGF، EGF و Extendin-4 تیمار شده ، و در مرحله ی بعد به مدت 5 تا 7 روز در معرض محیط کشت RPMI 1640 با گلوکز، HEPES ، Extendin-4 وActivin-A قرار می گیرند تا به سلول های Islet-like تمایز یابند. در ادامه ی آزمایش به منظورتأیید تمایز سلول ها، پروتئین C-peptide با استفاده از روش رنگ آمیزی ایمونوفلورسنت در آنها بررسی می شود، که در ابتدا سلول های کشت داده شده بر روی coverslip با پارافرمالدهید تثبیت شده و سپس با استفاده از Triton X-100 جهت ورود آنتی بادی نفوذپذیر می گردند و بعد از بلوکه شدن جایگاههای غیراختصاصی با BSA ، سلول ها با آنتی بادی اولیه تیمار می شوند و بعد ازشستشه و با آنتی بادی ثانویه رنگ آمیزی می گردند، و در پایان نیز هسته ها با یک رنگ فلوئورسنت رنگ آمیزی می شوند. همچنین به منظور بررسی تمایز سلول ها در سطح RNA ، با استفاده از کیت استخراج RNA ، RNA سلول ها استخراج شده و سپس با کیت RNA ، RT-PCR مربوط به ژن های Insulin و PDX-1 در حضور پرایمرهای مربوطه[15] به cDNA تبدیل می شوند و سپس محصولات نهایی بر روی ژل آگارز از یکدیگر جدا شده و پس از رنگ آمیزی با Ethidium Bromide مشاهده و بررسی می گردند، و در آخرین مرحله ، به منظور بررسی توانایی این سلول ها برای ترشح انسولین در پاسخ به گلوکز موجود در محیط، سلول ها ابتدا به مدت 4 ساعت در بافر Krebs-Ringer-Bicarbonate-HEPES (KRBH به همراهBSA تیمار شده و در ادامه به منظور تحریک ترشح انسولین ، سلول ها در بافر KRBH به همراه غلظت های متفاوتی از گلوکز و با Tolbutamide به مدت 2 ساعت کشت می شوند و سپس غلظت انسولین ترشح شده در محیط با استفاده ازکیت ELISA مربوطه به پروتئین انسولین اندازه گیری می گردد. دلایل ضرورت و توجیه انجام کار تعریف مساله مقدمه و بیان مساله: دیابت، بیماری که مبتلایان را به صورت مادام العمر درگیر می کند، با شاخص افزایش قند خون شناسایی می گردد. این بیماری دارای دو نوع I و II می باشد که در نوع I ، نابودی سلول های بتا موجب می شود که لوزالمعده، انسولین مورد نیاز بدن را تولید نکند و در نوع II این بیماری، انسولین تولید شده، کارایی لازم را در بدن افراد ندارد.در حال حاضر درمان رایج بیماران مبتلا به دیابت نوع یک، تزریق روزانه ی انسولین می باشد، ولی از آنجایی که تحت شرایط فیزیولوژیک متفاوت میزان نیاز بدن به انسولین تغییر می کند، این درمان اغلب موجب افزایش یا کاهش ناگهانی قند خون می گردد و حتی در شرایط کاملاً تحت کنترل، باز هم شاهد بروز آسیب دیدگی اعصاب، بیماری های قلبی-عروقی ،کلیوی و مشکلات بینایی در این دسته از بیماران هستیم. ترمیم سلول های بتای پانکراس از طریق پیوند، راه حل دیگری در زمینه ی درمان این بیماری می باشد که در این روش، تعداد محدود دهندگان در مقابل جمعیت بزرگ بیماران، مانع اصلی بر سر راه موفقیت این روش درمانی می باشد و همچنین بیمارانی که تحت این عمل پیوند قرار می گیرند می بایستی در تمام طول عمر خود از داروهای تضعیف کننده ی سیستم ایمنی استفاده کنند[1]. امروزه استفاده از سلول های بنیادی برای تولید جمعیت های جدیدی از سلول های بتا پانکراسی با قابلیت تولید انسولین، راه حل جدیدی را برای حل مشکلات بیماران دیابتی ارائه می نماید. درتحقیقاتی که در این زمینه در سالهای اخیر صورت گرفته، سلول های بنیادی جنین و همچنین سلول های بنیادی موجود در بافت های افراد بالغ به سلول های انسولین ساز تبدیل شده اند و بدین طریق مشکل افزایش قند خون در حیوانات مدل دیابتی حل شده است[8-2]. با توجه به روند رو به افزایش جمعیت مبتلایان به دیابت در سطح جهان و بویژه ایران، راهی مطمئن جهت تأمین انسولین مورد نیاز این دسته از بیماران در اینده جامعه مورد نیاز می باشد. از آنجایی که هم اکنون در کشور ایران، حدود پنج و نیم میلیون نفرمبتلا به دیابت می باشند و هزینه ی درمان این بیماری در کشور، بیش از هزار میلیارد ریال در سال برآورد می شود، استفاده از سلول های بنیادی، راه حلی منطقی برای کاهش هزینه های درمان بیماران دیابتی به نظر می رسد[9]. فهرست منابع و مراجع علمی داخلی فهرست منابع و مراجع علمی خارجی منابع و ماخذ: # عنوان منبع و ماخذ 1 Efrat S: Beta-cell replacement for insulin-dependent diabetes mellitus. Adv Drug Deliv Rev 2008, 60:114-123 2 Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, Velasco I, Ravin R, McKay R: Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001, 292(5520):1389-1394 3 Karnieli O, Izhar-Prato Y, Bulvik S, Efrat S: Generation of insulin producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells 2007, 25(11):2837-2844 4 Zalzman M, Gupta S, Giri RK, Berkovich I, Sappal BS, Karnieli O, Zern MA,Fleischer N, Efrat S: Reversal of hyperglycemia in mice by using human expandable insulin-producing cells differentiated from fetal liver Progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100(12):7253-7258 5 Kojima H, Fujimiya M, Matsumura K, Younan P, Imaeda H, Maeda M, ChanL: NeuroD-betacellulin gene therapy induces islet neogenesis in the liver and Reverses diabetes in mice. Nat Med 2003, 9(5):596-603 6 Ramiya VK, Maraist M, Arfors KE, Schatz DA, Peck AB, Cornelius JG: Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells. Nat Med 2000, 6(3):278-282 7 Bonner-Weir S, Taneja M, Weir GC, Tatarkiewicz K, Song KH, Sharma A, O'Neil JJ: In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97(14):7999-8004 8 Chandra V, G S, Phadnis S, Nair PD, Bhonde RR: Generation of Pancreatic Hormone-Expressing Islet-Like Cell Aggregates from Murine Adipose Tissue- Derived Stem Cells. Stem Cells 2009, 27(8):1941-1953 9 http://www.ir-diabetes-society.com 10 Fujikawa T, Oh SH, Pi L, Hatch HM, Shupe T, Petersen BE : Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cell-derived insulin-producing cells. Am. J.Pathl 2005.166, 1781–1791 11 Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S: Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007, 131(5):861-872 12 Park IH, Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H, Ince TA, Lerou PH, Lensch MW, Daley GQ: Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008, 451(7175):141-146 13 Tateishi K, He J, Taranova O, Liang G, D'Alessio AC, Zhang Y: Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts. J Biol Chem 2008, 283(46):31601-3160 14 Chen FG, Zhang WJ, Bi D, Liu W, Wei X, Chen FF, Zhu L, Cui L, Cao Y: Clonal analysis of nestin(-) vimentin(+) multipotent fibroblasts isolated from human dermis. J Cell Sci 2007, 120(Pt 16):2875-2883 15 Bi D, Chen FG, Zhang WJ, Zhou GD, Cui L, Liu W, Cao Y : Differentiation of human multipotent dermal fibroblasts into islet-like cell clusters. BMC Cell Biol. 2010 Jun 25;11(1):46 16 Hunziker E, Stein M: Nestin-expressing cells in the pancreatic islets of Langerhans. Biochem Biophys Res Commun 2000, 271(1):116-119 17 Zulewski H, Abraham EJ, Gerlach MJ, Daniel PB, Moritz W, Muller B, Vallej M, Thomas MK, Habener JF: Multipotential nestin-positive stem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo into pancreatic endocrine, exocrine, and hepatic phenotypes. Diabetes 2001, 50(3):521-533 خلاصه نتیجه اجرای طرح سابقه علمی طرح و پژوهشهای انجام شده با ذکر مأخذ به ویژه در ایران خلاصه طرح طبق اهداف پیش بینی شده WhatRequirementsAreMet ملاحظات گروه ملاحظات ناظر HomeAddress WorkPlace aAbstract مهمانان جلسه دستور جلسه آینده دستور جلسه چکیده پایان نامه خلاصه

-->

پیوست ها
hide/show

نام فایل تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود